研究林木基因资源遗传多样性是基因资源保存的前提，对培育林木新品种具有重要的指导意义。遗传多样性是伴随基因传递过程产生的同一物种个体间的变异，包括极其微小的、不易见到的变异(朱大保, 1994)。保护基因资源可以满足不同育种目标和未来的良种需要，包括应对特殊环境和病虫害都有赖于丰富的遗传多样性(魏润鹏, 1995)。

山杨木材结构均匀、质轻而软、颜色淡白，不用填充其他原料即可用于造纸(刘培林和赵其基, 1991)。随着社会对这一树种需求量的日趋增加，天然林已不敷需求，而多代萌生的山杨天然林心腐又很严重，不能满足培育纸浆用速生丰产林的需要。传统的林木育种方法周期长、见效慢，不可能在短时期内培育出符合实际生产需要的山杨造纸用造林新品种，而分子标记技术的快速发展及其在林木育种中的应用，为在短时期内培育出纤维性状优良、生长快的山杨纸浆材优良新品种提供了可能性。SSR即微卫星DNA，由于SSR标记技术呈共显性遗传，符合孟德尔遗传规律，能用PCR扩增、提供高质量的信息以及在单个微卫星位点上可做共显性的等位基因分析，试验重复性好，结果可靠性高等优点，是当今流行的分子标记技术之一(黄秦军等, 2002; 李新军等, 1999; 唐荣华等, 2002)。

本研究对东北地区6个山杨纸浆材优良种源的21个家系208株山杨个体进行遗传多样性分析，为深入研究山杨良种选育、杂交育种、杂种优势的利用、山杨定向培育奠定基础。

1 结果与分析
1.1SSR引物的筛选
查阅相关文献，寻找相关引物39对用于本次实验，以6个种源的山杨基因组DNA为模板，对引物进行筛选，每个样品重复2次，从中选出6对引物用于本次实验，引物名称与序列见表1。

表1 SSR引物名称与序列 Table 1 Name and sequence of SSR primer

1.2各引物在不同种源的扩增情况
利用选择的6对SSR引物(见表1)对6个种源的208株个体进行分析，所有引物均能够在供试品种中扩增出稳定明显的条带，说明选择的引物是适合的。图1为引物WPMS011对部分个体扩增结果。

图1引物WPMS011对部分个体扩增结果 注: M: 标准分子量100 bp DNA Ladder; 1~45: 不同山杨个体代码 Figure 1 The result of PCR for some individuals by primer WPMS011 Note: M: marker Ladder Plus 100 bp DNA Ladder; 1~45: Different codes of P. davidiana

本研究结果表2表明：本研究中从文献中找到的39对引物中筛选出的6对引物对所有6个种源208株个体中进行PCR检测，在引物预期产物大小片段处共扩增出29个位点，其中所有条带均具有多态性，多态位点百分率达到100%，每对引物扩增的DNA条带的数目在3~7条之间，平均为4.83条。可见，本次研究的各种源山杨具有较大的遗传多样性。

表2 6对有效引物在6个种源中的扩增情况 Table 2 The amplification result of 6 effective primers in 6 provenances

1.3山杨遗传多样性分析
利用PopGen32软件对山杨种源进行遗传多样性分析，由表3可知，山杨总体的Shannon指数为1.1001，各个种源的Shannon多态性信息指数变化范围在0.7508~1.1111之间，其中方正种源最大，铁力种源最小。Shannon指数总体平均值为0.9038。根据Shannon指数各种源排序为：方正＞湖上＞苇河＞曙光＞江山娇＞铁力。山杨种源总的Nei遗传多样性指数为0.5957，不同种源的Nei指数分布在0.4421～0.5944范围内。不同种源根据Nei指数排列的顺序与Shannon指数排列的顺序基本上一致。

表3山杨6个种源的多态性及遗传差异统计 Table 3 The polymorphic loci and genetic diversity in 6 provenances of P. davidiana

由表4可以看到：山杨的平均基因杂合度(Ave_Het)为0.5126。总体期望杂合度(Exp_Het*)为0.5971，不同种源间的变化范围为0.4534～0.6096，其中江山娇种源最低，湖上种源的期望杂合度的值最高。总体期望纯合度(Exp_Hom*)为0.4029，不同种源间的变化范围为0.3904～0.5466，其中湖上种源最低，江山娇种源最高。观察杂合度(Obs_Het)在0.4833～0.6083之间，其中江山娇种源最低，湖上种源最高。观察纯合度(Obs_Hom)变化范围为0.3917～0.5167，其中湖上种源最低，江山娇种源最高(表4)。

Nei遗传多样性指数的变化范围在0.4421～0.5944之间，其中江山娇种源最低，湖上种源最高。

表4 不同山杨种源的基因杂合度 Table 4 Genic heterozygosity frequency of different origins of P. davidiana resources

2.4山杨各种源间的遗传分化分析
6个山杨种源间的基因分化指数Gst＝0.1143，基因流系数Nm为1.9366。山杨种源内的遗传多样性占总群体的88.57%，种源间遗传多样性占总群体的11.43%，这说明山杨种源内变异占较大比例。

2.5山杨各种源间的聚类分析
山杨种源间的遗传一致度(I)和遗传距离(D)见表5。从表中可以看出，遗传一致度(I)和遗传距离(D)的变化范围分别为0.6079～0.9801和0.0201～0.4978。其中，湖上种源与江山娇种源的遗传距离最小，曙光种源与方正种源的遗传距离最大。

表5 山杨种源间遗传距离(下三角)与遗传相似度 Table 5 Nei's genetic distance (below diagonal) and genetic identity of provenances of P. davidiana

由遗传相似系数，进行UPGMA聚类分析，构建出6个不同山杨种源的遗传关系图(图2)。其中，湖上种源和江山娇种源的遗传距离比较近，聚为一类，方正种源与苇河种源距离比较近，聚为一类。

图2山杨种源间遗传关系聚类图 Figure 2 Genetic clustering of P. davidiana. based on genetic distance

2讨论
应用分子标记研究生物间的遗传关系时，引物数目和标记位点数对研究结果会有一定的影响。从理论上讲，所用引物数目越多、检测的位点数越多，提供的信息越可靠。但在实际操作中，受生物本身情况及时间、经费等因素制约，供分析利用的引物数目和位点数有限(王照兰等，2010)。张金然等采用5对SSR引物对52个山杨杂种无性系进行了遗传多样性检测，结果表明在研究的5个位点上SSR标记多态位点百分率为100%，平均等位基因数为4.4个，这说明SSR标记在山杨杂种中有很高的遗传多态性。本研究中筛选出的6对引物对所有6个种源208株个体中进行PCR检测，在引物预期产物大小片段处共扩增出29个位点，其中所有条带均具有多态性，多态位点百分率达到100%，每对引物扩增的DNA条带的数目在3~7条之间，平均为4.83条。可见，本次研究的各种源山杨具有较大的遗传多样性。

山杨种源间遗传分化指数Gst＝0.1143，说明种群间遗传分化较大。遗传结构通过物种种群内和种群间的遗传分化来实现，基因流的大小也可以反映种群遗传分化的大小。Wright认为，当Nm＞1时，证明种群间存在一定的基因流动，山杨6个种群间的基因流Nm为1.9366，证明山杨种群间存在一定的基因流动，能够降低局部变异，防止适应性分化。Harmrick和Godt (1990)的研究表明，居群的地理分布和遗传多样性分布没有直接的相关性。但也有研究表明遗传距离与地理距离之间有显著的相关性，如Alpert等在研究Frogaria chiloensis种群间的遗传分化时发现,遗传距离与种群间的空间距离高度相关(Alpert et al.,1993)。本研究结果表明：山杨不同种源的遗传多样性分布与地理居群没有显著的关联性。

3材料与方法
3.1材料
实验材料采自方正(FZ)种源、湖上(HS)种源、江山娇(JSJ)种源、苇河(WH)种源、铁力(TL)种源、曙光(SG)种源，于1993年定值于黑龙江省林口县青山林场山杨纸浆材优良种源保存林。2008年冬从优良种源采取山杨枝条，开展室内切枝水培，采取新鲜叶片于-20℃保存。

3.2实验方法
3.2.1 DNA提取
采用北京庄盟国际生物基因科技有限公司生产的ZP309-3植物基因组DNA提取试剂盒提取杨树基因组DNA，在1%琼脂糖凝胶中电泳检测其DNA样品的浓度和纯度。

3.2.2 SSR引物的筛选
查阅相关文献(Schoot et al., 2000; Rahman et al., 2000; 李世峰等, 2006)，寻找相关引物用于本次实验，以6个种源的山杨基因组DNA为模板，对引物进行筛选，每个样品重复2次，从中选出适合引物用于本次实验。

3.2.3 SSR反应体系
用于SSR-PCR反应的Taq酶、dNTP、Mg²⁺均购自MBI公司，引物购自上海生工生物工程公司。标准分子量100 bp DNA Ladder购自博大泰克公司。SSR-PCR扩增反应在美国ABI公司的VERITI型PCR仪上进行。

采用20 μL反应体系，其中含有0.5 U/μL的Taq酶，1.5 mmol/L的 Mg²⁺，30～50ng的模板DNA，0.15 mmol/L的dNTP，0.4 μmol/L的SSR引物，1×PCR Buffer。SSR扩增热循环参数见张金然的方法(张金然等，2006)。扩增产物在6%的变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，7 W下电泳150 min，银染后观察并照相。

3.2.4 SSR标记电泳谱带的记录与数据处理
根据电泳条带分析数据，一条为纯合，两条为杂合。然后用PopGen32软件进行分析，种群群体间的遗传距离及遗传一致度等；遗传距离的聚类分析用Mega2软件中的UPGMA聚类法。

作者贡献
王艳敏、白卉、李春明、李正华是本研究的实验设计和实验研究的执行人；王艳敏、白卉完成数据分析，论文初稿的写作；李春明、李正华参与实验设计，试验结果分析；邢亚娟是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由黑龙江省财政厅自拟项目“利用SSR标记技术进行山杨优良种源遗传多样性研究”；国家林业局林业公益性行业科研项目(201004060)；黑龙江省科技攻关重大项目(GA09B202-02)；中华人民共和国科学技术部农业科技成果转化资金项目(2009GB2B200103)资助。

本实验在黑龙江省林业科学研究所速生林木培育重点实验室完成，特此感谢！

参考文献
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